水稻（Oryza sativa）作为重要的粮食作物，其生长发育过程受到多种基因及其调控机制的复杂影响。其中，PPR蛋白（Pentatricopeptide Repeat Protein）是一类广泛存在于植物中的关键蛋白质家族，主要负责调控线粒体和叶绿体中的RNA代谢，参与植物光合作用、呼吸作用、花粉育性及胚乳发育等重要生物过程。OsCPPR1是水稻中一个细胞质定位的PPR蛋白，含有16个PPR基序，能够特异性结合并降解GOLDEN2-LIKE1 (OsGLK1)转录本，从而影响水稻花粉的正常发育。然而，OsCPPR1如何识别并结合OsGLK1 mRNA，以及以何种方式调控其表达水平，仍是未解之谜。庄楚雄研究员团队在其研究中揭示了水稻中定位于细胞质的PPR蛋白OsCPPR1在花粉发育中的功能，但OsCPPR1如何行使对RNA识别和结合所起的作用并未得到阐明。为此，华南农业大学近期发表的研究通过解析OsCPPR1蛋白的结构，揭示了其RNA识别与结合机制，为理解植物生长发育中的分子调控提供了新思路。水稻OsCPPR1蛋白RNA识别及结合特性分析，对于理解水稻的基因表达调控机制，乃至提高水稻的产量和抗逆性，具有重要的科学意义和实际应用价值。

图1

技术手段：

分子对接、圆二色谱（百泰派克提供技术支持）、RNA-EMSA

研究结果：

1、OsCPPR1的保守氨基酸和结构特征

在完整的PPR重复序列中，位于第5位的氨基酸残基负责序列对单链RNA碱基的特异性识别。为了分析每个PPR重复序列的残基是否对其结合活性或靶RNA识别至关重要，文章将每个PPR基序中第5位的氨基酸突变为丙氨酸（图2A），命名为OsCPPR1m；另外重组出两个OsCPPR1的截断版本(OsCPPR1(aa 135-end)/OsCPPR1(aa1 - 666))来探究不同的PPR基序是否会影响OcCPPR1与靶RNA的结合活性。研究结果表明，OsCPPR1的c端PPR重复基序比n端PPR基序更保守（图2B）；对这些OsCPPR1蛋白结构的预测表明，两种截断的OsCPPR1变异导致α 螺旋数和螺旋间角度发生不同变化；使用ProteinTools，可以观察到OsCPPR1m中比OsCPPR1中有更多的疏水簇和盐桥。

图2. OsCPPR1、OsCPPR1（aa135-end）和OsCPPR1（aa1-666）蛋白的结构和相似性分析

文章用圆二色谱（CD）分析了OsCPPR1和截断OsCPPR1的蛋白二级结构，结果表明每个PPR中第5个氨基酸的突变对OsCPPR1的二级结构有影响（图3）。这些数据表明，每个PPR中第5个氨基酸的突变可能导致蛋白功能活性的丧失。

图3. OsCPPR1、OsCPPR1（aa135-end）和OsCPPR1（aa1-666）蛋白圆二谱图

2、不同的OsCPPR1蛋白表现出不同的RNA相互作用活性

为了确定PPR重复基序与不同的OsCPPR1和靶RNA的结合活性之间是否存在关系，文章利用OsGLK1 G4-RNA（先前的靶结合RNA片段）通过大分子对接实验预测了完整的OsCPPR1、两个截断的OsCPPR1变体和OsCPPR1m的RNA结合活性。预测结果表明每个PPR基序（OsCPPR1m）的突变能显著影响RNA结合，并且结合能力是这些蛋白中最弱的（图4）；OsCPPR1、OsCPPR1（aa 135-end）和OsCPPR1（aa 1-666）不同程度地与RNA结合，但相互作用位点并不一致（图4）。文章使用OsGLK1 G4探针进行了RNA-电泳迁移转移实验（EMSA），发现缺乏N-端PPR基序的OsCPPR1比缺乏C-端PPR基序的OsCPPR1表现出更强的相互作用活性（图5）。这些结果表明，OsCPPR1结构的改变改变了酶的活性，OsCPPR1的C-端PPR基序在结合活性中起重要作用。

图4. 不同的OsCPPR1蛋白与RNA的相互作用

图5. RNA-EMSA实验

3、5′-RNA连接酶介导的cDNA末端快速扩增（RLM-5′RACE）鉴定OsGLK1 RNA裂解位点

文章在野生型和OsCPPR1过表达植株中进行了RLM-5′RACE实验，在OsCPPR1过表达植物和野生型中检测到类似的OsGLK1 mRNA切割模式位点。与前期研究一致，这些位点的分布不集中在OsGLK1 mRNA任何区域，且分布位置分散。这一结果表明，OsCPPR1可能只优先与靶RNA结合，但对靶RNA的切割活性可能需要其他辅助因子，需要在未来的研究中进一步探索。

图6. 在野生型（WT）和OsCPPR1过表达（CPPR1-OE）植株中，5′-RNA连接酶介导的cDNA末端产物快速扩增的位置

研究结论：

本研究通过结构分析和靶RNA序列识别的大分子对接实验揭示了水稻OsCPPR1蛋白RNA识别及结合特性分析过程中OsCPPR1蛋白的结构基础和功能特性，深入解析了其在水稻基因表达调控中的重要作用，证明了OsCPPR1的识别和结合活性依赖于一套完整的PPR基序。每个PPR基序中的第5个氨基酸可能通过为靶RNA识别提供独特的接口并在OsCPPR1中发挥保守作用；不同的OsCPPR1截断版本强调了所有PPR基序在RNA-EMSA中发挥的关键作用。这些结果共同表明，OsCPPR1直接结合OsGLK1 mRNA，可能与完整的PPR基序相关。这不仅加深了我们对PPR蛋白家族的理解，也为未来通过分子育种手段优化水稻基因表达调控网络提供了新的科学依据。

百泰派克生物科技致力于为科研人员提供全面的蛋白质组学和多组学技术支持，拥有丰富的技术经验和高效的实验平台。在华南农业大学针对水稻OsCPPR1蛋白RNA识别及结合特性分析的研究中，百泰派克通过圆二色谱等先进技术手段，为OsCPPR1蛋白的结构解析提供了强有力的支持。未来，百泰派克将继续为广大科研伙伴提供高质量的技术服务，助力更多重要科学发现的实现。

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